骨組織RNA快速提取試劑盒
 

　　產品信息
 

　　產品名稱產品編號規格
 

　　骨組織RNA快速提取試劑盒
 

　　產品描述
 

　　骨組織堅硬、骨細胞密度低、而且外周基質含有大量黏蛋白(蛋白多糖)和RNA難以分離，無法用傳統Trizol法進行高質量提取。本試劑盒采用的不含苯酚/氯仿配方的裂解液，并添加多種成分去除骨組織蛋白多糖。同時基因組DNA清除柱技術可以有效清除gDNA殘留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。裂解液迅速裂解細胞和滅活細胞RNA酶， 離心沉淀去除多糖和次級代謝產物，然后裂解混合物用乙醇調節RNA結合吸附到基因組DNA清除柱，然后RNA被選擇性洗脫濾過， 吸附在基因組DNA清除柱上的殘留DNA無法洗脫連同柱子一起丟棄從而清除掉DNA。濾過的RNA用乙醇調節結合條件后，RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質去除， 最后低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。
 

　　運輸和保存方法
 

　　1)本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。
 

　　2)不合適的儲存于低溫(4℃或者-20℃)會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運輸和儲存均在室溫下(15℃-25℃)進行。
 

　　3)避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。
 

　　注意事項
 

　　1.所有的離心步驟均可在室溫完成(4℃離心也可以)，使用轉速可以達到13,000 rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
 

　　2.需要自備乙醇，研缽或者其它合適的破碎骨組織裝置。
 

　　3.樣品處理量絕對不要超過基因組清除柱DA和和RNA吸附柱RA處理能力，否則造成DNA殘留或產量降低。開始摸索實驗條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時可使用較少的樣品處理量， 將來根據樣品試驗情況增加或者減少處理量。
 

　　4.裂解液CLB和RLT Plus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
 

　　5.關于DNA 的微量殘留:
 

　　1)選用跨內含子的引物，以穿過mRNA中的連接區，這樣DNA就不能作為模板參與擴增反應。
 

　　2)選擇基因組DNA和cDNA上擴增的產物大小不一樣的引物對。
 

　　3)將RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理。本試劑盒還可以用于DNase I處理后的RNA清潔(cleanup) ，請聯系我們索取具體操作說明書。
 

　　4)在步驟去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上進行DNase I柱上消化處理。購買DNA酶柱上消化試劑盒(貨號：RN34)前可先索取具體操作說明書。。
 

　　6.本產品僅作科研用途!
 

　　使用方法
 

　　提示：
 

　　→第一次使用前請先在漂洗液RW瓶中加入指定量無水乙醇!
 

　　→取1ml裂解液 CLB至離心管內(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解)，在裂解液CLB中加入100μl PLANTaid，顛倒混勻后65°C水浴中預熱。多個樣品按照比例放大準備
 

　　1.液氮研磨法:
 

　　1)骨鉗夾碎骨組織后放入研缽(研缽在180度干烤2小時)，加入液氮后反復研磨成細粉，注意液氮蒸發后不斷補加保存液氮一直存在。
 

　　2)轉移30mg-150mg細粉加至預熱的裂解液CLB(已加有PLANTaid)離心管中。立即劇烈渦旋30-60秒或者用吸頭吹打混勻裂解直得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高產量。
 

　　骨組織差異極大，用戶應該根據不同骨組織的具體情況和實驗結果增減或者減少處理的樣品量。以獲得更好的產量和純度。
 

　　立刻接操作步驟的步驟3。
 

　　2.其它骨組織破碎方法：
 

　　1)取30mg-150mg骨組織加入1ml預熱的裂解液CLB(已加有PLANTaid)高速均質儀粉碎勻漿。或者取30mg-150mg液氮冷凍包埋切片粉碎的骨頭加入裂解液CLB(已加有PLANTaid)粉碎勻漿。
 

　　2)立刻接操作步驟的步驟3。
 

　　3.短時放回 65°C水浴中(10 min)，中間偶爾顛倒1-2次幫助裂解。
 

　　4.將裂解物4°C 13,000 rpm離心10分鐘，沉淀不能裂解的碎片。
 

　　5.取裂解物上清(在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產量)轉到一個新離心管。加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時可能出現沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。
 

　　若上清表面有漂浮物，用吸頭挑開吸取下面液體即可。
 

　　6.將混合物(每次小于720μl，多可以分兩次加入)加入一個基因組清除柱中，(清除柱放入收集管中)13,000 rpm離心2分鐘，棄掉廢液。
 

　　確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。
 

　　7.將基因組DNA清除柱子放在一個干凈2ml離心管內(不用RNAse free 或者DEPC處理，一般干凈的新離心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干凈收集管)，在基因組清除柱內加500μl裂解液RLT Plus，13,000 rpm離心30秒， 收集濾液(RNA在濾液中)，用微量移液器較精確估計濾過液體積(通常為450-500μl左右，濾過時候損失體積應該減去)，加入0.5倍體積的無水乙醇，此時可能出現沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。
 

　　8.立刻將混合物(每次小于720μl，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13,000 rpm離心2分鐘，棄掉廢液。
 

　　確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。
 

　　9.加700μl 去蛋白液RW1，室溫放置1分鐘，13,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
 

　　10.加入500μl漂洗液RW(請先檢查是否已加入無水乙醇!)，13,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RW，重復一遍。
 

　　11.將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
 

　　12.取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water(事先在 70-90℃水浴中加熱可提高產量)， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。
 

　　洗脫緩沖液體積不應少于30 μl，體積過小影響回收效率。如果需要得到更大濃度的RNA，將離心得到的RNA溶液加回到吸附柱重復洗脫一遍。
 

　　注：以上資料僅供參考，不作為實驗數據，具體請咨詢品牌供應商或技術老師;
 

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