PCR實(shí)驗(yàn)常見問(wèn)題及解決方案

　　以下是天正信達(dá)PCR實(shí)驗(yàn)常見問(wèn)題及解決方案的系統(tǒng)性總結(jié)：

　　一、擴(kuò)增失敗類問(wèn)題

　　無(wú)擴(kuò)增條帶?

　　酶失活：更換新酶或不同品牌酶制劑

　　模板問(wèn)題：

　　• 含甲酸等雜質(zhì)(石蠟包埋樣本需特殊處理)

　　• 濃度不足(建議梯度稀釋驗(yàn)證)

　　溫度異常：校準(zhǔn)PCR儀溫度，變性溫度建議93-94℃/1min

　　假陰性結(jié)果?

　　引物降解：PAGE電泳驗(yàn)證引物完整性

　　抑制物干擾：純化模板或改用柱式提取試劑盒

　　退火溫度過(guò)高：梯度PCR優(yōu)化(推薦55-65℃范圍)

　　二、產(chǎn)物異常類問(wèn)題

　　現(xiàn)象 主要原因 解決方案

　　非特異性條帶 引物二聚體/Mg2?濃度過(guò)高 降低引物量至0.1-1μM，調(diào)整Mg2?至1.5-2mM

　　拖尾/彌散 循環(huán)數(shù)過(guò)多/dNTP濃度偏高 減少循環(huán)至30-35次，dNTP濃度控制在200μM以下

　　產(chǎn)物量不足 延伸時(shí)間過(guò)短/模板量低 按1kb/min延長(zhǎng)延伸時(shí)間，增加模板至50-100ng

　　三、污染與質(zhì)控

　　假陽(yáng)性污染?

　　操作規(guī)范：

　　• 分裝試劑避免反復(fù)凍融

　　• 使用帶濾芯槍頭

　　環(huán)境控制：前/后PCR區(qū)域物理隔離

　　數(shù)字PCR優(yōu)化?

　　低頻突變檢測(cè)：結(jié)合預(yù)擴(kuò)增技術(shù)可將靈敏度提升至0.1ppm

　　四、關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化

　　引物設(shè)計(jì)?：

　　• 長(zhǎng)度18-27bp，GC含量40-60%

　　• 避免3'端互補(bǔ)(BLAST驗(yàn)證特異性)

　　循環(huán)參數(shù)?：

　　變性94℃/30s → 退火(梯度優(yōu)化)→ 延伸72℃/1kb/min

　　注：白色孔板專用膜可提升低濃度樣本檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度

　　注：以上資料僅供參考，如需完整產(chǎn)品說(shuō)明，建議聯(lián)系供應(yīng)商獲取最新版本.

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